Ciężki złożony niedobór odporności (severe combined immunodeficiency, SCID) to grupa wielu rzadkich chorób monogenowych charakteryzujących się defektami, zarówno komórkowej, jak i humoralnej odporności nabytej. Pacjenci rodzą się zdrowi, a ze względu na ich wyjątkową podatność na patogeny we wczesnym okresie życia, pojawiają się u nich nawracające infekcje, które, nieleczone, mogą być śmiertelne. Jeden z podtypów choroby jest spowodowany mutacją w genie 2 aktywującym rekombinację (recombination-activating gene 2, RAG2). RAG1 i RAG2 to geny zaangażowane w krytyczny etap dojrzewania komórek T i B, w którym dochodzi do wytwarzania zróżnicowanego repertuaru receptorów komórek T i B (T-cell receptor, TCR; B-cell receptor, BCR). Zatem u pacjentów z chorobotwórczymi wariantami genów RAG zazwyczaj występuje całkowity brak lub znaczna redukcja limfocytów T i B.
Obecnie jedynym dostępnym sposobem leczenia RAG2-SCID jest allogeniczne przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych. Ograniczeniem jest jednak dostępność odpowiedniego dawcy przeszczepu, jak również ryzyko poważnych powikłań procedury, takich jak odrzucenie przeszczepu czy choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi. Alternatywą może być zastosowanie metody edycji genów CRISPR-Cas9/rAAV6 do modyfikacji własnych komórek macierzystych i progenitorowych pacjenta. Obiecującym podejściem jest edycja genomu za pośrednictwem naprawy ukierunkowanej na homologię (homology-directed repair, HDR) CRISPR-Cas9, która umożliwia precyzyjne wstawienie genu. Jednakże metoda ta wiąże się z nieodłącznym ryzykiem, szczególnie w przypadku niektórych podtypów SCID, takich jak RAG2-SCID, gdzie insercja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 HDR może prowadzić do niekontrolowanej aktywności nukleazy RAG2 i szkodliwych zmian strukturalnych.
W odpowiedzi na ten problem naukowcy z Uniwersytetu Bar-Ilan w Izraelu zaproponowali nowatorską strategię modyfikacji genów o nazwie GExHDR 2.0: Find and replace (pl. Znajdź i zamień). Metoda ta łączy edycję genomu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 z rekombinowanymi wektorami związanymi z adenowirusem serotypu 6 (recombinant adeno-associated serotype 6, rAAV6), będącymi dawcami DNA, aby precyzyjnie zastąpić sekwencję kodującą RAG2, zachowując jednocześnie elementy regulacyjne. Strategia ta kryje w sobie potencjał nie tylko dla RAG2-SCID, ale także dla innych genów z regionami gorącymi dla mutacji chorobotwórczych.
Innowacyjny aspekt tego podejścia polega na skutecznym wyzwalaniu edycji genomu za pośrednictwem HDR w celu precyzyjnej zamiany sekwencji kodującej. Aby to osiągnąć, badacze oddzielają ramię homologiczne położone dystalnie od miejsca rozszczepienia i dopasowują je do segmentu znajdującego się bezpośrednio poniżej sekwencji wymagającej wymiany. Wydłużenie długości dystalnego ramienia homologicznego u dawcy odgrywa kluczową rolę w tym procesie. Zachowując endogenne elementy regulatorowe i sekwencje intronowe, ta nowatorska strategia wiernie odtwarza naturalne poziomy ekspresji genów, minimalizując ryzyko związane z nieuregulowaną ekspresją genów.
Doktor Ayal Hendel z Wydziału Nauk Przyrodniczych na Uniwersytecie Bar-Ilan wyraził entuzjazm co do potencjału tego podejścia i jego zastosowań terapeutycznych: „Ta przełomowa technika, która polega na zastąpieniu całych sekwencji kodujących lub eksonów, przy jednoczesnym zachowaniu kluczowych elementów regulacyjnych, daje nadzieję pacjentów z RAG2-SCID i jest obiecująca w leczeniu innych zaburzeń genetycznych” – powiedział.
Na podstawie: